Muestra De Heces Para Analysis Essay

Clostridium difficile toxigénico

Clostridium difficile es un bacilo grampositivo anaerobio, productor de esporas, que se encuentra en el suelo y en el tracto intestinal de animales y humanos y puede colonizar hasta el 50% de niños menores de un año, del 3 al 5% de los adultos sanos y a un mayor porcentaje de pacientes adultos hospitalizados o de residencias de ancianos. C. difficile produce diarrea asociada a antibióticos, pero los síntomas pueden variar desde portadores asintomáticos, diarrea moderada o leve y colitis seudomembranosa2,24,25. Las cepas patógenas tienen un locus de patogenicidad que codifica para la toxina A, una enterotoxina codificada por el gen tcdA, y la toxina B, una potente citotoxina codificada por el gen tcdB2,25, aunque pueden no presentar la toxina A y solo la toxina B. La cepa hipervirulenta NAP1/027/B1 se ha asociado con mayor morbimortalidad y produce mayor expresión de toxina, una esporulación más eficiente y la expresión de una toxina binaria, aunque no todas las cepas que se detectan actualmente presentan estas características de virulencia2,26.

Ante pacientes con factores de riesgo para diarrea por C. difficile, tanto hospitalizados como no hospitalizados, se deben realizar pruebas de detección de toxinas A y B, de forma rápida, para iniciar el tratamiento antibiótico y aplicar medidas de control para evitar la diseminación a otros pacientes.

Los métodos más utilizados son:

Detección de antígeno. Detección de glutamato deshidrogenasa (GDH) mediante EIA o partículas de látex. La GDH es un antígeno muy abundante de la pared celular de C. difficile y su detección es muy sensible pero poco específica, ya que está presente tanto en cepas toxigénicas como no toxigénicas2,24,27.

Detección de toxinas A y/o B. Se puede realizar mediante pruebas de citotoxicidad o mediante técnicas de ICT o de EIA4,28. La prueba de citotoxicidad se considera el método de referencia para detección de toxina B en las heces, con una alta sensibilidad y especificidad, pero es muy laboriosa, además de no ser una prueba rápida. Existen numerosas pruebas de EIA comerciales para la detección de toxinas A, B o las dos. Se recomienda utilizar técnicas de EIA que detecten toxina B o las 2, por las cepas productoras solo de toxina B. Sin embargo, estas técnicas comerciales tienen baja sensibilidad comparadas con cultivos celulares, por lo que es necesario utilizar técnicas de detección de ácidos nucleicos2,28. La detección de toxina a partir del aislamiento obtenido por cultivo no se debe utilizar como método único, pues requiere varios días para su crecimiento, pero su utilización, además de la detección directa de toxina, puede aumentar en un 10% la positividad29.

Detección de genes de las toxinas A/B mediante amplificación de ácidos nucleicos. Es la técnica que ofrece mayor sensibilidad y especificidad, aunque es más cara. Existen diferentes PCR en tiempo real, que permiten detectar C. difficile, la toxina B, y la toxina binaria en 90min. GeneXpert presenta un 98% de acuerdo con la prueba de referencia y mayor sensibilidad que la ICT4,30. Sin embargo, una muestra puede ser positiva mediante método molecular y negativa mediante EIA y cultivo celular, por lo que pueden surgir dudas del significado clínico2,27.

Para llegar a un diagnóstico correcto y que sea coste-efectivo, se deben usar alguno de los siguientes algoritmos2,24,25: 1) hacer GDH EIA y estudiar la presencia de toxina con método molecular cuando sea positivo, 2) hacer la combinación de GDH y toxina A/B EIA de forma simultánea y confirmar las muestras con resultados discrepantes entre ellas con método molecular o 3) hacer solo el método molecular a todas las muestras.

Escherichia coli

Escherichia coli puede formar parte de la microbiota intestinal normal, pero algunas variantes (consideradas patovariedades o patotipos) tienen capacidad de producir diarrea y son causa de morbimortalidad en todo el mundo31. Se definen por la expresión de uno o más factores de virulencia: enteropatógeno (ECEP), productor de toxina Shiga (ECTS), también llamado enterohemorrágico o productor de verocitotoxina, que incluye al serotipo O157, enteroinvasivo (ECEI), enterotoxigénico (ECET), enteroagregativo (ECEA) e invasivo adherente2,31.

En la mayoría de los laboratorios clínicos y de salud pública solo se estudia ECTS y se define por la presencia de los genes de las toxinas Shiga 1 (stx1) y/o Shiga 2 (stx2). El cultivo permite detectar solo E. coli O157, pero los métodos independientes del cultivo detectan tanto los O157 como el resto2. El CDC recomienda realizar simultáneamente el cultivo diferencial para detectar E. coli O157 y el estudio molecular para la detección de stx1 y stx2, en heces de pacientes con diarrea aguda adquirida en la comunidad y con posible síndrome urémico hemolítico32. Si no se dispone de un método molecular se debería enviar a un centro de referencia.

Se pueden utilizar: 1) EIA Stx, que permiten detectar, y en algunos casos diferenciar, stx1 y stx2, a partir de un caldo enriquecido incubado una noche a 37°C, tanto de ECTS O157 como no-O157, y 2) técnicas moleculares, que detectan los genes stx1 y stx2 directamente de las heces, y que es el método más sensible2. Recientemente se ha publicado la utilización de una nueva ICT realizada directamente en muestras de heces con excelentes resultados30.

Campylobacter

Se han desarrollado pruebas de detección de antígeno de Campylobacter a partir de muestras de heces, en formato de ELISA, en placa de micropocillos o en formato de ICT de flujo lateral. Aunque son métodos más rápidos que el cultivo, presentan menor sensibilidad y no diferencian entre Campylobacter jejuni y Campylobacter coli. Existen métodos moleculares para realizar directamente de las heces, que son los más sensibles, pero no están suficientemente validados2.

Técnicas rápidas para detección de otras bacterias productoras de diarrea

Un test rápido (ICT, dipstick) permite detectar Shigella a partir de colonias, y directamente de las heces o de los exudados rectales, gracias a anticuerpos monoclonales frente al lipopolisacárido4. Las enterotoxinas de Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Clostridium perfringens se pueden detectar en alimentos, heces o en cepas cultivadas mediante métodos comerciales, mediante técnica de aglutinación pasiva reversa por látex o técnica de EIA33.

Helicobacter pylori

Para el diagnóstico rápido de la infección por H. pylori se han utilizado diferentes técnicas, ya que el cultivo de la biopsia es lento y exigente34.

Basadas en la ureasa de H. pylori. H. pylori tiene una potente ureasa y esta característica se utiliza, desde el inicio del descubrimiento de H. pylori, para su diagnóstico, en 2 tipos de pruebas: ureasa rápida a partir de la biopsia y test del aliento.

Si se incorpora un trozo de biopsia en un caldo o gel de urea, se producirá el cambio de color a rosa en pocos minutos. La prueba de la ureasa se puede utilizar para identificar la bacteria obtenida por cultivo, pero se utiliza principalmente como práctica habitual en las unidades de endoscopias. La primera que se comercializó con este fin fue el CLO-test, con la que se obtenían resultados positivos entre 30min y 3h, aunque podía dejarse hasta 24h, lo que suponía pérdida de especificidad por otras bacterias ureasa positivas. Actualmente existen diferentes marcas comerciales, que buscan acortar el tiempo para obtener el resultado35.

Para realizar la prueba del aliento con urea (urea breath test [UBT]), el paciente ingiere urea marcada y se recogen muestras del aliento antes y 30min después de la ingestión. Si H. pylori se encuentra en el estómago, hidrolizará la urea y se liberará CO2 marcado. Se puede utilizar un isotopo radioactivo, 14C, o un isotopo no radiactivo, 13C, que es el más utilizado y se puede medir con un espectrómetro de masas o de infrarrojos35. Es la prueba no invasiva de elección para el diagnóstico y seguimiento del paciente con H. pylori por su alta sensibilidad y especificidad (del 95 al 100%) para detectar infección activa35,36.

Basadas en la detección de anticuerpos. Existen numerosas pruebas serológicas para detectar anticuerpos anti-H. pylori IgG en el suero del paciente. La principal limitación es que no diferencian la infección activa de la pasada y es necesario que el kit que se utilice esté validado a nivel local35. Es útil para estudios epidemiológicos y cuando existe sangrado gastrointestinal, gastritis atrófica, cáncer gástrico o linfoma MALT (mucosa associated lymphoid tissue), ya que puede producir una baja carga bacteriana en el estómago y disminuirá la sensibilidad de otras pruebas diagnósticas36,37. También existen pruebas para detectar anticuerpos de H. pylori en orina o saliva, con resultados variables, por lo que actualmente no se recomienda su uso en el manejo del paciente35,38,39.

Basadas en la detección de antígeno en heces. La prueba de antígeno en heces es una prueba no invasiva y cualitativa, que detecta el antígeno de H. pylori que se ha eliminado en las heces. Se pueden usar: 1) como prueba para el diagnóstico inicial de la infección; 2) para el control del tratamiento (al menos 4 semanas después de terminarlo), y 3) para estudios epidemiológicos.

El primer kit que se desarrolló fue un EIA con anticuerpos policlonales39, aunque actualmente no se recomienda por tener menor sensibilidad y especificidad que los que utilizan anticuerpos monoclonales35,39. De los numerosos métodos comercializados que utilizan anticuerpos monoclonales, EIA o ICT presentan diferente precisión diagnóstica. Se obtienen mejores resultados con los kits basados en EIA en formato de micropocillos39 y se consideran equivalentes al UBT en el consenso de Maastricht34,35. Existe también un inmunoanálisis quimioluminiscente automatizado con resultados comparables al EIA34.

En 2 estudios que evaluaban ICT se observó sensibilidad del 93 y del 95% y especificidad del 89 y del 87% para el diagnóstico pretratamiento, y sensibilidad del 94 y del 100% y especificidad del 97 y del 91% para el seguimiento postratamiento35. En un estudio reciente se compararon 3 ICT comerciales y se observó que RAPID Hp StAR (Oxoid) era el más sensible (91-92%) pero el menos especifico (77-85%), mientras que para Uni-Gold™ H.pylori Antigen (Trinity Biotech) y para ImmunoCard STAT! HpSA (Meridian), se observó una sensibilidad del 83% y una especificidad del 90% (87-89%)40. En otros estudios también se han observado valores más bajos de sensibilidad y/o especificidad, por lo que se considera que las ICT necesitan mejorar para que sean fiables40.

Basadas en métodos moleculares (PCR). Desde hace muchos años se han utilizado métodos moleculares caseros para el diagnóstico de la infección por H. pylori a partir de diferentes muestras como biopsia gástrica, heces, saliva, jugo gástrico, etc. Además, permiten el estudio de mutaciones de resistencia a macrólidos como claritromicina (gen 23S ARNr), fluoroquinolonas (gen gyrA), tetraciclinas (gen 16S ARNr), rifabutina (gen rpoB) y amoxicilina (gen pbp-1a)41,42, y tienen las ventajas de la rapidez, de la mayor sensibilidad que el cultivo con métodos fenotípicos de sensibilidad a antibióticos, y detectan resistencia heterogénea, que puede ser difícil de obtener por cultivo39,43.

En el último consenso de Maastricht, se considera realizar estudios de sensibilidad a claritromicina, si se va a utilizar este antibiótico como primera línea de tratamiento, en regiones con tasa de resistencia mayor del 15%, tanto por cultivo y antibiograma como por un método molecular directamente de la biopsia36.

Existen varios kits comerciales basados en PCR en tiempo real que detectan H. pylori directamente en la biopsia; otros métodos, además de H. pylori, detectan las principales mutaciones que confieren resistencia a claritromicina44-47 (tabla 4). También existe un kit comercial basado en PCR y posterior hibridación en línea (GenoType HelicoDR) que permite detectar resistencia a claritromicina y a fluoroquinolonas. Se ha descrito sensibilidad del 94 al 100% y especificidad del 86 al 99% para la detección de resistencia a claritromicina y sensibilidad del 83 al 87% y especificidad del 95 al 98,5% para resistencia a fluoroquinolonas39,48, aunque en otros estudios se han observado datos más bajos tanto para claritromicina como para fluoroquinolonas39,49. Algunos de los kits comercializados pueden detectar H. pylori y su resistencia a claritromicina a partir de muestras de heces (Amplidiag H. pylori+ClariR, Mobidiag o ClariRes real-time PCR, Ingenetix), aunque no hay todavía artículos publicados.

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